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ナノファイバーによる分子レールを開発 ナノ医療診断ツールの開発や人工細胞の構築などにつながる可能性
5月 19th
微小物質を運搬できるナノメートルサイズの繊維でできた「分子の線路」を開発.
京都大学 大学院工学研究科の浜地 格教授らは、ナノテクノロジーの鍵となる材料の１つとして期待されているナノメートルサイズの直径を持った新しい繊維（ファイバー）を開発し、それがたんぱく質分子やナノ粒子などの物質を輸送する線路「分子レール」として機能することを実証した。「Nature Communications」に掲載された。
生物の細胞内では、生体物質を細胞内の色々な場所へ効率よく輸送するために、たんぱく質の自己組織化によってできた微小管のような一次元ファイバーが発達しており、このファイバーの上をモーターたんぱく質が種々の物質を結合して運ぶことが知られている。例えば、細胞内に存在するたんぱく質の自己組織化によって形成されている微小管は、モーターたんぱく質に結合した種々の生体物質を目的の場所に輸送するレールとして働いている。
近年、ナノテクノロジー分野の材料開発において、分子の自己組織化を利用したボトムアップアプローチによって作製されたナノファイバーが、電子やホールを輸送できるナノ電子材料としての可能性が提唱されている。しかし、自己組織化ナノファイバーが生体の微小管のように分子や物質輸送のレールとなりうる可能性については、ほとんど明らかになっていなかった。
研究グループは、水にも油にも馴染む性質を持った両親媒性分子が形成する自己組織化ヒドロゲルと、その基本構造であるナノサイズの極細繊維の機能開発を進めている。
自己組織化によりナノファイバーを形成する両親媒性分子の構造
研究グループは今回、合成分子同士が集まってできた直径10〜100nmの人工ナノファイバーを開発し、その性質を詳細に調べた。ファイバー内では、ファイバーの構成分子同士が繊維構造を維持したまま活発に運動して行き来し、構成分子は川の流れのような流動性を持っていることが分かった。また、この移動の挙動は、ファイバー構成分子が持っている電荷に依存して変化し、ファイバーに電場をかけることでコントロールできることも明らかになった。
そして、この自己組織化ナノファイバーを物質輸送のレールとして利用するために物質結合部位を導入すると、たんぱく質やナノ粒子がナノファイバー表面に結合して、そのファイバー上を一次元的に移動することも分かった。
自己組織化による物質結合能を有するナノファイバーの形成と結合したナノ物質の移動の概念図
すなわちナノファイバーが分子のレールとなって物質を運んでいることも発見した。特に、ナノ粒子の場合には、その動きを１個ずつ独立に顕微鏡によって観察することができることから、ナノ粒子がファイバー上を運動している様子を直接可視化して、解析した。
また、この自己組織化ナノファイバーはマイクロ流路（高さと幅が共に数10µｍの小さな流路）を利用すると、その向きを揃えることも可能で、ビーズの移動を直線状にコントロールできることも明らかにした。
マイクロ流路中で配向させた自己組織化ナノファイバーにナノビーズが結合し、長軸に沿って運動していることを可視化した顕微鏡画像（スケールバー＝５µｍ）。左と中央は各時間でファイバー上のナノビーズ（１、２、３、４）の位置を捉えた画像、右は各ナノビーズが１分３９秒６３０ミリ秒の時間内で１次元方向に往復運動した軌跡（赤、紫、青、緑の線で表示）を画像に重ねたもの。
詳しい検証の結果、ビーズの運動速度（0.3µｍ/s）は分子レールを構成している両親媒性分子がファイバー中を流れる速度とほぼ一致した。
このことは、レールに結合した物質はレール自身の流れ、すなわち両親媒性分子の流動性を利用して運ばれることを示している。つまり、微小管などの生体輸送システムとは全く異なったメカニズムを持った人工の分子レールができたことを意味する。また、その速度はある種の微小管結合たんぱく質あるいはDNA結合たんぱく質が微小管、もしくはDNA上を一次元ランダム運動する速度（拡散係数＝0.1〜0.4µｍ^2/s）とほぼ同じで、分子の世界では十分早いものだったという。
開発したナノファイバーによる分子レールは、細胞内ファイバーの物質輸送システムとはメカニズムは全く異なる。だが、色々な環境下で使用できる新たな物質輸送用ナノレールとしての応用は、極微小で微量な物質の輸送・分離、またその解析につながることが期待出来るという。
これまでにボトムアップアプローチで作製された分子マシンでは、ナノメートルスケールの分子運動でしか実現していなかった。今回のように顕微鏡でも観察可能な、マイクロメートルスケールにもおよぶ分子の運動と移動を制御した人工システムは、ほとんど例がないという。
生体の微小管上の分子モーターのように、望みの条件で動きの方向性を制御するためには新たな戦略が必要になる。ナノファイバーに結合した物質の動きの方向性の制御が重要だと考えられるという。現在ファイバーに結合したナノ物質の動きは一次元に制御されてはいるものの、その運動方向はランダムで、現時点では方向性を規制するためには電場を利用する必要がある。
今回のような人工分子レールシステムは、マイクロメートルスケールにおける極微小で微量のナノ物質の輸送・分離や解析を利用したナノ医療診断ツールの開発や人工細胞の構築などにつながる可能性がある。
力学的に細胞全体が変形すると細胞核も変形する 流れに曝された内皮細胞内部の変形の様子を可視化
3月 25th
流れに曝された内皮細胞内部の変形の様子を世界で初めて可視化
—細胞の“力”への応答メカニズムの解明へ.. | 受賞・成果等 | 東北大学 -TOHOKU UNIVERSITY-.
東北大学大学院医工学研究科の佐藤正明 教授，工学研究科 坂元尚哉 助教、工学研究科大学院生で日本学術振興会 植木洋輔 特別研究員らの研究グループは，血流を模擬した流れの中に曝された内皮細胞の断面像をリアルタイムに可視化し，変形挙動を観察することに世界で初めて成功したと発表した。
細胞の「力」に対する応答メカニズムを明らかにし，血管病理の解明や再生医学の発展に貢献することが期待されるという。アメリカ速報誌「Biochemical and Biophysical Research Communications」誌オンライン版で公開された。
血管の最も内側の面（内腔面）は，内皮細胞と呼ばれる細胞の層によって覆われている。この細胞は，血液と組織中の物質透過性の制御や、管径の調節など重要な機能を多数持っている。また動脈硬化症や動脈瘤といった血管疾病の発生にも関わっている。
内皮細胞は血液に直接接触するために，血液の流れによって生じる「せん断応力」という力学的な刺激に絶えず曝されている。
これまでの研究で、せん断応力が内皮細胞の様々な機能や遺伝子発現に影響を与え，血管疾病の発生にも密接に関わっていることが明らかになりつつあった。細胞が力を感知する上で「メカノトランスダクション」と呼ばれる力学的な刺激から生化学的な反応への変換過程が近年注目を集めており、いくつかのタンパ
ク質分子などが、メカノトランスダクションを担うセンサーとして機能していることが分かっている。
しかし、せん断応力を負荷された内皮細胞においては，細胞のどの位置に存在するどの種類のセンサーに、どのぐらいの大きさの力が負荷されているのかという情報が不足していた。
今回の研究では、機械工学的な見地から「せん断応力を負荷された内皮細胞はどのように変形しているのか」という基本的なポイントに着目した。
生きた培養内皮細胞にせん断応力を負荷しながら共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いた断層観察を行って、細胞の変形挙動をリアルタイムに観察した結果、細胞全体だけでなく、細胞核もせん断変形挙動を示していることが分かった。このことから、従来は一般的に細胞核は細胞質よりも硬いと信じられていたが、実際には周囲の細胞質と同程度の軟らかさであり、細胞表面または細胞底面と細胞核の間には、機械的な接続が存在することが示唆された。
また、細胞核の変形や細胞核への伝わる力が遺伝子発現に影響を及ぼすことが考えられていることから，細胞核自身が流れ刺激に対するセンサーとして機能している可能性も示唆される。
さらに，この断層像から画像相関法や有限要素法を用いて，細胞内の変形量を定量的に解析した結果、従来の試験方法で得られた細胞の硬さから推定するよりも，実際には細胞がより大きく（最大で10倍ほど）変形することが明らかになった。今回のこの結果は、これまでにない力学的かつ定量的情報であり，今後の内皮細胞のせん断応力に対する応答メカニズム解明を大きく前進させることが期待されるという。
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川崎重工と産総研、細胞自動培養ロボットシステム「R-CPX」を開発
3月 16th
再生医療向けに高品質・高効率な細胞自動培養ロボットシステムを開発
川崎重工業株式会社と独立行政法人産業技術総合研究所（産総研）は、再生医療と遺伝子治療の2分野で必要とされる細胞培養を対象とし、 多人数の細胞を同時に、完全自動で培養できるロボットシステム「R-CPX（Robotized-Cell Processing eXpert system）」の実用機を開発したと発表した。
2台のクリーンロボットが並行動作を行うことで熟練技術者の複雑な動きを再現して培養作業の完全自動化を実現した。また過酸化水素蒸気による除染機能を装備し、装置内を常に無菌に保つ。培養作業以外にも装置内で手作業ができるようにして、システム全体の汎用性を高めている。
そのほか、画像処理によって細胞の培養状態を自動判定したり遠隔監視機能のほか、生産管理技術を応用することで細胞の履歴管理なども行える。
システム全体の大きさは幅３８００×奥行き２２５０×高さ１９３０（mm）で、中に2台のロボットが入っており、二人分の仕事を協調 してこなす。ロボット本体は半導体作業用のロボットに対し特殊なめっきを施した6自由度のマニピュレータで、材質はアルミとステンレスを使用している。
……続きは、『ロボコンマガジン』（オーム社）でご覧下さい。2010年５月号（4月15日発売号）に掲載予定です。実際に取材してきましたので。
個人的には、再生医療＋ロボットと、かつて取材していた二つの領域が重なり、色んな意味で感慨深いものがありました。今回のロボットを開発した方とも、こういうリリースの時にしかお会いしないのですが、かれこれ１０年以上の付き合いになります。
もっとも、実用においてはやはり厚生労働省の認可がどうなるかなどなど、技術以外の問題が壁として出てきそうです。そのへん、経済産業省と厚生労働省で話し合って良いほうに動かしていってほしいものですが。
一つ、「ロボコンマガジン」の原稿には多分書かない情報を付け加えておくと、同種の自動細胞培養機械にはThe Automation Partnership (TAP) 社の「Cellmate」というロボットがあります。ただこちらはおそらく過酸化水素蒸気による除染機能などは持っていないだろう、とのことです。詳細はあまり明らかにされていないそうです。
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理研、分子1つ1つを再現する細胞シミュレーション法を開発 次世代スパコンで細胞丸ごとシミュレーションを目指す
1月 29th
分子1つ1つの運動まで再現する細胞シミュレーション法を開発｜2010年 研究成果｜独立行政法人 理化学研究所.
独立行政法人理化学研究所（理研）基幹研究所 生化学シミュレーション研究チームの高橋恒一チームリーダーとオランダの原子分子物理研究所のピーターレイン・テンウォルデ教授らは、細胞内に存在する分子1つ1つの運動まで精密に再現する細胞シミュレーションの要素技術の開発に成功したと発表した。アメリカ科学アカデミー紀要『Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America: PNAS』2月9日号に掲載されるに先立ち、1月25日の週にオンライン掲載された。
新たな計算手法は「enhanced Greens Function Reaction Dynamics(eGFRD)法」と呼ばれるもので、これは、これまでは年単位で必要だった計算時間を数日以内に短縮できる計算手法だという。この新技術を国産の細胞シミュレーター「E-Cell」の次世代版に搭載し、神戸に建設中の「次世代スーパーコンピュータ」で活用することで、細胞丸ごとシミュレーションを目指すという。細胞のがん化や幹細胞の分化の予測と制御などに貢献できる成果だとしている。
従来の細胞シミュレーションでは、細胞内の分子1つ1つの運動を考慮せず、分子間の相互作用を回路図のように表現し、分子の数の増減だけを扱う「ネットワークモデル」や、細胞内の場所による平均的な濃度の違いを表現する「濃度平均場モデル」といった手法が主流だった。一方、観察技術の急速な発展で、1分子単位のゆらぎや運動が生命機能に重要な役割を果たしていることが明らかになっていた。シミュレーションにおいても生体分子1つ 1つの運動まで考慮に入れた「1分子粒度」の手法が求められていた。
しかし、従来の1分子粒度の手法である「ブラウン動力学」を用いて、細胞丸ごとの規模で精度よくシミュレーションを行うには、ごく簡単な場合でも年単位の膨大な計算量が必要だった。逆に現実的な時間で計算を終えようとすると、大きな計算誤差を許容することとなり、不正確なシミュレーションを行ってしまうのが問題とされていた。
研究グループは、細胞丸ごと規模での1分子粒度モデルを実現するために、粒子反応拡散計算手法「enhanced Greens Function Reaction Dynamics(eGFRD)法」を開発した。この手法は、ブラウン動力学法よりも飛躍的に性能が向上するだけでなく、原理的には系統誤差が生じないという優れた特性を持っているという。
従来の手法では、細胞内のすべての分子を少しずつ動かし、そのたびに分子と分子の衝突が発生するかどうかを判定し、化学反応をシミュレーションしていた（図1左）。この時、どの位置、どの時点で分子の衝突が起こるのかをいかに精密に計算できるかがシミュレーションの精度と直接関係するため、小さな時間間隔で非常に多くの計算を繰り返す必要があった。
だが「eGFRD法」では、分子を少しずつ動かすのではなく、ある分子がほかの分子に邪魔されることなく自由に動ける範囲「保護領域」を設定し、分子が保護領域に入って何秒後に抜け出るかを計算する（図1右）。そして、この計算を多数の分子に別々に（非同期に）適用する。2つの分子が近くにある時は、分子が2つ入った保護領域の中で、分子の運動と反応を一度に計算する。これにより、一度に進めることができる時間間隔を拡大させることができ、計算量が大幅に減り、飛躍的に計算時間を短縮できた。
また、分子が保護領域に入って出るまでにかかる時間（第一通過時間)や反応が起きるまでにかかる時間を、基礎物理方程式の厳密解を直接用いて計算するため、原理的には系統誤差の無いシミュレーションが可能になり、シミュレーションの精度も大幅に向上した。
図1 従来の計算手法とeGFRD法との比較。eGFRD法では、分子が自由に運動できる保護領域を設定するため、一度に大きな距離を進められる。
また、研究グループは「eGFRD法」を「MAPキナーゼ（MAPK）」のシミュレーションに適用した。MAPKは、細胞表面で受容した情報を処理し、細胞核内の遺伝子発現機構に引き渡す役割を持つ細胞内情報処理分子。1つのMAPK分子は2つのリン酸化部位を持ち、その両方のリン酸化部位が「MAPキナーゼキナーゼ（MAPKK）」という酵素分子によってリン酸化（二重リン酸化）されると活性化して、下流に情報を伝える。
MAPKが情報を伝達する際には、主に「段階的応答」、「超敏感応答」、「二重安定応答」の3つの応答様式のいずれかで行うと考えられている。「段階的応答」では、細胞表面の受容体分子が受け取った信号を遺伝子発現系にそのまま受け渡す。「超敏感応答」では、受け取る信号から雑音を取り除き、オンかオフかのデジタルな信号に変換して遺伝子発現系に渡す。「二重安定応答」では、デジタル化に加え、過去の信号の種類によって現在の応答を変化させるため、MAPKは記憶素子として働くことができると考えられている。
研究グループは、MAPKの二重リン酸化を、従来の「ネットワークモデル」と、今回可能になった分子1つ1つの運動を考慮する「1分子粒度モデル」の2つの手法で計算し、結果を比較した（図2）。すると、従来のネットワークモデルが「二重安定応答」を予測するケースであっても、1分子粒度モデルではそれが消失する場合があることを発見した。
図2 MAPK系のシミュレーション（EはMAPKK、SはMAPK、Pはリン酸基）。MAPKの二重リン酸化を、空間中の分子の運動を考慮しないネットワークモデルと、空間を考慮した1分子粒度モデルで計算し、結果を比較した。
MAPKをリン酸化する酵素であるMAPKKが、1つ目のリン酸化部位をリン酸化してから、次のリン酸化部位をリン酸化することができるようになるまでには一定の時間（緩和時間）がかかる。例えば、MAPKKは、リン酸化を行うためのリン酸基をATP分子から受け取り、リン酸基を渡したATPはADPになる。MAPKKが次のリン酸化を行うためには、ADPを離し新しいATPの供給を受けなければならない。今回のシミュレーションにより、緩和時間が短い場合には、「二重安定応答」が消失することが分かった（図3）。同様に、「超敏感応答」が「段階的応答」に変化する場合があることや、刺激に対するMAPKの二重リン酸化の速度がこれまでの予測よりも速く、MAPKの拡散速度に反比例する場合があることも分かった。
従来のネットワークモデルは、生体分子1つ1つの運動を考慮せず、分子が衝突し、反応を起こす確率が均一であるとする「化学マスター方程式」理論に基づいている。今回の分子1つ1つの運動を考慮した「eGFRD法」を用いたシミュレーションにより、MAPKが情報伝達を行う「超敏感応答」や「二重安定応答」などの応答様式の発生条件が、これまでの理論とは大幅に異なる場合があることが分かった。これまで、MAPKの反応機構においては実験結果と理論とが必ずしも一致しないことが謎とされていた。今回の成果によりMAPKの反応機構の解明が一層進むことが期待できるという。
図3 MAPKシミュレーションの結果。酵素の緩和速度が速くなると、MAPKの二重安定応答が消失する場合がある（赤丸）。
今回の成果により、「eGFRD法」を用いれば特定の分子にターゲットを絞れば在来の計算機でも細胞丸ごと規模でのシミュレーションが可能であることが分かった。「eGFRD法」を細胞シミュレーター「E-Cell」の次世代版に搭載し、次世代スーパーコンピュータで活用することで、細胞内に存在する多くの種類の分子の同時シミュレーションや、多数の細胞からなる組織のシミュレーションへ道を開くことになるという。
具体的には、複数の情報伝達経路同士の相互作用（クロストーク）の影響や、細胞内の分子の混み合い方（分子混雑）が及ぼす影響、また細胞同士が信号分子を交換してコミュニケーションを行う様子など、さらに高度なシミュレーションが実現する可能性がある。最終的には、細胞のがん化の機序の解明を通じて創薬へ貢献できたり、幹細胞（万能細胞）の分化の予測と制御を通じて再生医療の実現へとつなげられると期待される。
さらに、研究グループでは、この技術を有用微生物の設計に適用すれば、環境問題やエネルギー問題の解決の糸口を見いだす可能性もあるとしている。
